1.2供試培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基參照文獻[4]配制PDA培

養(yǎng)基。

1.2.2纖維素降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)纖維素降 解酶形成的不同培養(yǎng)基配方見表1。在制作過程 中，應(yīng)先用適當?shù)乃訜崛芙怍燃谆w維素鈉，再溶 解其他物質(zhì)，后調(diào)pH值15。每個三角瓶(200mL) 加液體培養(yǎng)基100mL,高壓蒸汽滅菌30min。

表1誘導(dǎo)纖維素降解酶形成的不同培養(yǎng)基配方

化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)基I培養(yǎng)基II

KNO3(g)2.02 0

KCl(g)0.50 5

FeSO4(g)0. 010 01

K2HPO4(g)1.01 0

MgSO4 D 7H2O(g)0 50 5

維生素B|(mg)0 20 2

L一天冬酰胺(g)

羧甲基纖維素鈉(g) 去離子水(mL)0 5 1 00005

1000

pH5.05 0

1.2.3玉米稻稈發(fā)酵培養(yǎng)基稱取3. 00g玉米稻 稈粉(取自河南科技大學(xué)周山校區(qū)試驗田，經(jīng)干燥、 粉碎，過孔徑為0. 9mm的分樣篩）加入到20個 250mL的三角瓶中，分別加入0.02g CaS〇4、0.06g MnS〇4、15mL自來水，混勻，121 ~ 125 Q滅菌 30 min 備用1 fl]。

1.3 溶液配制

1.3.1醋酸一醋酸鈉緩沖溶液取0. 05mol/ L醋

酸鈉(AR)溶液(稱取4. 1015g無水醋酸鈉溶解于適 量的水中并定容1000mL)—定量，加入0. 05mol/L的 醋酸(AR)，用25型酸度計調(diào)pH至5.0。

1.3.2 1%羧甲基纖維素鈉稱取1.00g羧甲基 纖維素鈉溶于醋酸一醋酸鈉緩沖溶液（0.05mol/ L,

pH5. 0)中，定容至 100mL。

1.3.3 DNS顯色劑稱取3, 5^二硝基水楊酸 6. 3g，2mol/L 的 NaOH 溶液 262mL,加到 500mL 含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶解（溫度低于 50 Q)再加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶 解。冷卻后加蒸饋水定容至1 000mL,放置過夜，過 濾后貯于棕色瓶中備用171。

1. 3.4中性洗滌劑準確稱取18. 6g乙二胺四乙 酸二鈉和6.8g四硼酸鈉，均放入1000mL燒杯中， 加入少量蒸餾水，加熱溶解后，再加30g十二烷基 硫酸鈉和10mL乙二醇乙醚;稱取4. 56g無水磷酸 氫二鈉置于另一燒杯中，加入少量蒸餾水加微熱熔 解后倒入第一個燒杯中，再轉(zhuǎn)入定量瓶中稀釋至 1000mL，此溶液的pH值在6.9~7.1左右|8]。 1.3.5200^g/mL葡萄糖標準液準確稱取

0. 1000g分析純葡萄糖(預(yù)先在80Q烘箱中烘干至 恒重)，置于小燒杯中，用少量的去離子水溶解后定 量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以少量的去離子水 定容至刻度，搖勻，再稀釋成200,ug/mL，置冰箱中 保存?zhèn)溆?。

1.4測定方法

1.4.1葡萄糖標準曲線的制作參照文獻[9],略 有改動。

1.4.2|3 -1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的提取與酶活性的測

定

1.4.2. 11,4-內(nèi)切葡聚糖酶的提取將卩1菌株

在PDA培養(yǎng)基上進行純化與擴大繁殖，25 Q下恒 溫培養(yǎng)3d后在菌落邊緣處用打孔器（1. 0cm)打下 菌片，向1.2.2中的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加5個菌片， 25 Q下振蕩培養(yǎng)3d、4d、5d、6d、7d、8d，過濾除去 菌絲和抱子，在4 Q 8000r/min下離心15min,棄 去沉淀，留上清液，即為待測酶液。

1.4.2.2P-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶活性的測定取一 支25mL的潔凈比色管，加入0. 5mL酶液，0. 5mL醋 酸一醋酸鈉緩沖溶液(0.05mol/L，pH5.0), 1mL 1% 的羧甲基纖維素鈉（pH 5. 0)，混合均勻后迅速放入 37 〇水浴中反應(yīng)30min,取出后立即放入100Q水 浴中煮沸15 min中止反應(yīng)，冷卻后加入1. 5 mL DNS顯色劑(3, 5-二硝基水楊酸），100 Q水浴中顯 色5 min,以顏色深淺程度用去離子水定容25 mL或 10mL,在722型光柵分光光度計540nm處測定反 應(yīng)混合液吸光度值，根據(jù)酶反應(yīng)釋放的還原糖量計 算Cx的活性1101。對照：酶液先以100Q下煮沸 15min中止反應(yīng)，再加入底物，其余操作同上。平行

o.O.Io.

勢，在第5天時酶活性最高(表2)。

表2 Fi菌株在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中的產(chǎn)酶活性

培養(yǎng)天數(shù)(d)

345678

對照吸光度0.0570 .0730 0890. i020. i2i0. i30

反應(yīng)液吸光度0.0890. i380 2530 2080. i790. i62

反應(yīng)液與對照差值0.0320. 0660. i640. i060 0590 032

酶活（g/mL)75 .00i3i. 67295 00i98. 33i20. 0075 00

重復(fù)3次。

Cx的酶活單位為37 C下30min每毫升酶液催 化底物釋放1?還原糖的量(?/mL)。

1.4.3 Fi菌株對玉米秸稈中半纖維素、纖維素和 木質(zhì)素的降解能力的測定

i.4.3.i玉米秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)將分離純化的 Fi菌株接種到液體纖維素降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上， 25 °C振蕩培養(yǎng)5d即得液體菌種；將液體菌種按 i0%的接種量接入玉米秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基上， 25 C靜置培養(yǎng)[iu]。

1.4.3.2固體發(fā)酵樣品的制備和酶液的提取每 5d、10d、15d、20d取固體發(fā)酵樣品，用150mL pH5. 0的醋酸一醋酸鈉緩沖液浸泡3h，過濾，濾渣 于60 °C烘箱中烘干，用于測定其中的纖維素、半纖 維素和木質(zhì)素的含量；濾液定容至200mL,在4°C， 8000r/min下離心i5min,棄去沉淀，留上清液，即 為待測酶液，用于測定酶活。

1.4.3.3玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的 含量測定用差重法[ii’i21測定玉米秸稈中纖維素、 半纖維素和木質(zhì)素的含量。

2 結(jié)果與分析

2. i葡萄糖標準曲線

采用3, 5-二硝基水楊酸法測定葡萄糖的含量。 根據(jù)測定結(jié)果，獲得葡萄糖標準曲線（圖i)回歸方 程:y = 0. 00i2x-0. 0i3, R2= 0.9946。

°- ：J[y=0.001 2x -0.013 j

〇• 25 ■R '=0.994 6

0. 05 ■

0,IIiiI1

050100150200250300

葡萄糖穴.(吒/ml.)

圖1葡萄糖標準曲線

2.2 Fi菌株在2種纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶 活性

2.2.1 Fi菌株在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中的產(chǎn)酶 活性 Fi菌株在以CMC為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3d、4d、5d、6d、7d、8d，提取、純化培養(yǎng)液，測定Cx 酶的活性。結(jié)果表明，CMC能夠誘導(dǎo)Cx酶的產(chǎn) 生，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，CMC誘導(dǎo)Fi菌株產(chǎn)生纖 維素酶的活性也發(fā)生了變化，呈先升高后降低的趨 2.2.2 Fi菌株在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基II中的產(chǎn) 酶活性 Fi菌株在以無CMC為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基II 中培養(yǎng)3d、4d、5d、6d、7d、8d提取、純化培養(yǎng)液， 測定Cx酶的活性。結(jié)果表明，沒有CMC的誘導(dǎo)， Fi菌株中幾乎沒有Cx酶的產(chǎn)生。由表3可以看 出，隨著天數(shù)的增加，產(chǎn)生Cx酶的變化不大，而且 幾乎沒有酶活，表明Fi菌株需在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下才 能使纖維素酶產(chǎn)生并具有活性。

表3 Fi菌株在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基II中的產(chǎn)酶活性

培養(yǎng)天數(shù)( d)

項目345678

對照吸光度0. 00i0 0020. 00i00. 00i0. 00i

反應(yīng)液吸光度0 0030 0050 0030 0030 0020 003

反應(yīng)液與對照差值 0 0020 0030 0020 0030. 00i0 002

酶活（g/mL)25 0026 6725 0026 6723 3425 00

由圖2可知，以羧甲基纖維素鈉為誘導(dǎo)物的培 養(yǎng)基中，F(xiàn)i菌株產(chǎn)生的Cx酶隨著培養(yǎng)時間的增加， 呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在培養(yǎng)5d時酶的活性 最高。此后，酶活逐漸下降，到第8天時酶活下降基 本與第3天時相同。而無羧甲基纖維素鈉為誘導(dǎo)物 的培養(yǎng)基中，F(xiàn)i菌株中幾乎沒有Cx酶的產(chǎn)生，而且 酶活性變化不大。

菌絲依然生長旺盛;第10天菌絲生長緩慢;第15天 菌絲大部分因基質(zhì)發(fā)干而停止生長。

2.3. 2玉米秸稈基質(zhì)中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素 含量變化從表4可知，用差重法測定？1菌株對玉 米秸稈中的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解能力， 結(jié)果表明，三者的含量隨時間的増加不斷的減少，在 培養(yǎng)的前15d對纖維素和木質(zhì)素的降解都很快，之 后對纖維素的降解速率明顯降低甚至停止降解。培 養(yǎng)20d,對半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的累計降解速 率為3. 5%、10. 5 %、7.0%，說明在整個培養(yǎng)期間 Fi菌株對玉米秸稈中纖維素的降解速率最快，對木 質(zhì)素的降解速率相對較慢，對半纖維素的降解速率 最慢。

表4 F,菌株對玉米秸稈中半纖維素.纖維素和

木質(zhì)素的降解率（％)

項目 ■培養(yǎng)時間（）

05101520

半纖維素含量29.528. 527.026 526 0

降解率01 02 53 03 5

纖維素含量44.541. 539 035 034. 0

降解率03. 05 59 010 5

木質(zhì)素含量16.014. 011 510 09 0

降解率02. 04.56 07 0

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，在以羧甲基纖維素鈉為誘導(dǎo)物 的培養(yǎng)基中，F(xiàn)i菌株能夠產(chǎn)生Cx酶，而且在第5天 時酶活性最強。Fi菌株在玉米秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中的 生長情況良好，培養(yǎng)前15d, Fi菌株對纖維素和木質(zhì) 素的降解都很快，之后對纖維素的降解速率明顯降 低甚至停止。培養(yǎng)20d對半纖維素、纖維素和木質(zhì) 素的累計降解速率為3.5%、10. 5%、7.0%。

本研究證實了 CMC能誘導(dǎo)Fi菌株產(chǎn)生纖維素 酶，且以第5天時酶活性最高，說明CMC是一種有 效的纖維素酶誘導(dǎo)劑，F(xiàn)i菌株經(jīng)誘導(dǎo)可以產(chǎn)生纖維 素酶來分解纖維素，這一結(jié)果與國外報道的其他 CMC促使菌種產(chǎn)酶的結(jié)果相一致A141。今后對纖 維素酶的作用機制以及如何提高纖維素酶的降解能 力需要做進一步的研究。

我國纖維素類資源極為豐富，但其利用率很低， 使用微生物肥料可以把這些天然纖維素物質(zhì)降解為 可利用的物質(zhì)（糖液、酒精、氣體燃料等）有利于秸 稈還田，改善植物的營養(yǎng)狀況，還能夠抵抗某些病原 微生物的致病作用，減輕病蟲害，増加產(chǎn)量1151。這 對解決我國乃至世界的糧食短缺、能源危機、環(huán)境污 染、病蟲害防治等問題具有深遠的意義。今后應(yīng)進 一步加強微生物肥料的研究和開發(fā)工作，相信在不 久的將來，利用微生物肥料高效降解纖維素生產(chǎn)將成為現(xiàn)實。