心腦血管疾病是威脅人類健康的三大疾病之一。 現(xiàn)已證明人體血液中低密度脂蛋白濃度的升高以及 由此引起LDL在血管壁中的過氧化是動脈粥樣硬化 (AS)等心血管病發(fā)生的主要原因，降低血液中過高 的LDL能有效地預(yù)防和阻止其發(fā)生m。纖維蛋白原 (Fib)是血液中重要的凝血因子，含量過高可能會導(dǎo) 致高粘滯血癥及各種心腦血管疾病。大幅度的清除 Fib對改善血液流變指標(biāo)、改善血液狀況和防治高 粘滯血癥具有積極作用[21。目前血液LDL凈化方法 主要包括血漿置換、膜過濾、免疫親合吸附、物 理化學(xué)吸附及肝素誘導(dǎo)沉淀等技術(shù)。目前對誘導(dǎo)沉 淀的研究多集中于類肝素物質(zhì)如磺化多糖類物質(zhì)[\ 黃原膠是甘蘭黑腐病黃單胞菌(Xanthomonas Camparis)所產(chǎn)生的-種胞外多糖，具有聚p -1，4- P比 喃型葡萄糖的主鏈以及含糖的側(cè)鏈如丙酮酸和乙酸 基因，其聚合物骨架結(jié)構(gòu)類似于纖維素，側(cè)鏈上的 葡萄糖醒酸和丙酮酸群賦予了黃原膠負(fù)電荷。整個 分子結(jié)構(gòu)中則含有大量的伯、仲醇羥基。通過羧甲基化反應(yīng)可以使所得衍生物具有大量羧基。降解黃 原膠羧甲基化衍生物應(yīng)用于血漿脂蛋白誘導(dǎo)沉淀技 術(shù)未見報道H1。

本文以黃原膠為原料，通過降解、羧甲基化研 制出新型血漿凈化劑。研究和討論了降解中酸濃 度、降解時間、降解溫度對多糖分子質(zhì)量的影響。 羧甲基化反應(yīng)中分子質(zhì)量、氫氧化鈉和氯乙酸比值 對羧甲基含量的影響。以降解黃原膠羧甲基化衍生 物為凈化劑，考察用量、凈化體系pH值對凈化效 果的影響，確定較優(yōu)的凈化條件。

1材料與方法

1.1原料與試劑

黃原膠(上海化學(xué)試劑站分裝廠）、新鮮豬血、 透析袋(截留分子質(zhì)量3,500，上海源聚生物科技有 限公司)、氯乙酸(AR，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑 公司）、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸鈉、冰醋酸、乙 醇、異丙醇等試劑為市售分析純或化學(xué)純。

722分光光度計；恒溫水浴鍋(HH-2A>電動離 心機(80-2>循環(huán)水式真空泵(SH2-D型> 真空干燥 箱(DZF-6020塑)；精密酸度計(PHS-3C型>，烏式 粘度計。

1.2實驗方法

1.2.1降解黃原膠的制備

取一定量的黃原膠分散于l〇〇mL乙醇溶液中， 置于250mL三口燒瓶。加人一定量的HC1，在一定 溫度下恒溫水浴，攬拌使黃原膠分散均勻，反應(yīng)停 止后抽濾再置于60弋烘箱中烘干。

1.2.2羧甲基降解黃原膠的制備【5】

取2.5g降解黃原膠加入裝有撹拌及回流冷凝裝 置的250mL三口燒瓶中，加人50mL95%異丙醇溶 液，攪拌條件下加人一定量NaOH固體粉末。于室 溫(20 下經(jīng)行堿化反應(yīng)。

1 h后在攪拌條件下緩慢加人溶有一定量氯乙酸 的異丙醇10mL，50丈水浴下反應(yīng)2h，再加人 2gNaOH粉末，反應(yīng)lh〇

反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物倒出，傾去上清液，以1:1 HC丨調(diào)節(jié)體系pH為7,再以90%乙醇清洗3次，抽 濾，于60^下烘干。

1.2.3純化處理

將干燥后的羧甲基降解黃原膠溶于去離子水后移 入透析袋中，以去離子水充分透析，直至透析液以

AgN03溶液檢驗無cr檢出。透析液濃縮后在50弋 下真空干燥至恒重，即獲得純凈的降解黃原膠羧甲

基化衍生物。

1.2.4血漿LDL及Fib的誘導(dǎo)沉淀

以冰醋酸和醋酸鈉配制不同pH值的HAC-NaAC 緩沖溶液，同時將不同質(zhì)量的竣甲基降解黃原膠溶 解其中，獲得不同濃度不同pH值的凈化劑緩沖溶 液。取一定體積的血漿，按1:1體積比加入上述凈 化劑緩沖溶液中，體系有沉淀物形成。于3,000rpm/ min下離心分離沉淀物，取上清液分析血漿總膽固 醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇((HDL-C)、纖維蛋白 原(Fib)及血漿總蛋白質(zhì)(TP)等指標(biāo)。

1.3分析指標(biāo)與方法

13.1降解黃原膠的相對•分子質(zhì)量粘度法測定[61。 1.3.2測定產(chǎn)物羧甲基含量指示劑酸堿滴定法m。 1.3.3紅外光譜分析常規(guī)KBr壓片法。

1.3.4血漿(血清)總膽固醇濃度(CTC)乙醇抽提，磷 硫鐵顯色法[8]。

1.3.5高密度脂蛋白膽固醇濃度(CHDI^Ch)磷鎢酸鈉- Mg2+沉淀，磷硫鐵顯色法[9]。

1.3.6低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白膽固醇濃度(Ci Ch+VU3L.Ch)由計算得到：Cu>K；h+VLDL"Ch=CTC-CHDL-Co 1.3.7血漿(血清)總蛋白質(zhì)濃度(Cn〇雜脲顯色法[丨0丨。 1.3.8血漿纖維蛋白原濃度(CF,b)亞硫酸鈉沉淀-雙 縮脲顯色法[1<)1。-

1.3.9 清除百分率(RP%) RP=(CB-CA)/CB *100。

式中C為血清或血漿中TC、HDL-Ch、LDL- Ch+VLDL-Ch的濃度，mg/L;下標(biāo)A、B分別為 凈化后及凈化前。

2結(jié)果與討論

2.1降解黃原膠的制備條件優(yōu)化

以水浴降解黃原膠各單因素試驗為依據(jù)，選擇 酸濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度為考察因素，隨機 安排各因素的水平順序。并以粘度為降解結(jié)果考察 依據(jù)(見表1、表2)。

表1正交實驗的因素與水平

因素123

A HC 丨濃度(mol.L“）0.100.150.20

B溫度(<C)506070

C加熱時間(h)1.01.52.0

由正交實驗極差分析可得，各個因素對產(chǎn)物粘 度影響的大小順序為：酸濃度>反應(yīng)時間>反應(yīng)溫

 

表2正交實驗結(jié)果

試驗號A HC1 濃度(mol，L_l)B溫度(<C)C加熱時間(h)粘度(Pa • s)

10.10501.01.62

20.10601.51.43

30.10702.01.16

40.15502.01.18

50.15601.01.25

60.15701.51.36

70.20501.51.42

80.20602.01.33

90.20701.01.44

K14.204.224.29

K23.793.744.21

K34.193.963.67

R1.040.480.63

氫氧化鈉與氯乙酸用量比對取代度的影響如圖2所示。

 

度。優(yōu)化實驗條件為：酸濃度為0.1 5mol • I/1， 60^下水浴加熱2h。

2.2羧甲基化實驗條件的優(yōu)化

由于黃原膠粘度較大，過高的溫度，反應(yīng)時間 過長或反應(yīng)體系水含量較多都會使反應(yīng)物糊化結(jié) 塊，使得反應(yīng)無法進(jìn)行，所以根據(jù)實驗將反應(yīng)溫度 控制在501，并采用干法制備，直接加人固體的 氫氧化鈉[51。

2.2.1黃原膠分子質(zhì)量對羧甲基化取代度的影響 固定黃原膠用量為2.5g,氫氧化鈉用量為 10g,氯乙酸用量為10g,堿化時間lh,醚化時間 3h,二次加堿量為氫氧化鈉2g,反應(yīng)溫度50^。 黃原膠分子質(zhì)量對羧甲基取代度的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著黃原膠分子質(zhì)量的減小，反 應(yīng)更易進(jìn)行，所得產(chǎn)物羧甲基取代度更高，因黃原 膠原膠分子質(zhì)量較大，在一百萬左右。而降解至兩 萬以下羧甲基化反應(yīng)便可較易進(jìn)行。

2.2.2氯乙酸與氫氧化鈉用量比對羧甲基化取代度的 影響

固定黃原膠用量為2.5g，分子質(zhì)量為180,000, 堿化時間為lh,醚化時間為3h,反應(yīng)溫度為50丈，

圖2 NaOH:MCAA對取代度的影響 由圖2可知，當(dāng)氯乙酸的用量增加時，多糖分 子附近的酸濃度增大，因此羧甲基化的程度增大， 但當(dāng)氯乙酸過多會與氫氧化鈉反應(yīng)引起反應(yīng)體系溫 度迅速升高，使得部分溶劑異丙醇揮發(fā)損失，體系 中醇水比例發(fā)生改變，新生成的產(chǎn)品會很快溶脹、 結(jié)塊使反應(yīng)無法進(jìn)行，造成狻甲基取代度下降，所 以，一般取氫氧化鈉與氯乙酸的比值為2:1.8。 2.2.3降解黃原膠羧甲基化衍生物的紅外表征 .FTIR譜圖3中的l,637cm“為結(jié)合水峰，1,022 

及1，421 cm—1出現(xiàn)了-COO-的對稱和非對稱伸縮振動蛋白凈化效果隨降解黃原膠羧甲基化衍生物濃度的 峰，表明羧甲基連接到了黃原膠分子上。變化關(guān)系。

2.3降解黃原肢羧甲基化衍生物來度和凈化體系pH 對血漿凈化效果的影響

影響LDL誘導(dǎo)沉淀的主要因素包括凈化劑濃度 和體系pH值。下面將分別考察兩者對血漿凈化效果 的影響。

2.3.1降解黃原膠羧甲基化衍生物濃度對血漿脂蛋白 凈化效果的影響

用含有不同濃度的降解黃原膠羧甲基化衍生物 的緩沖溶液，按1:丨體積比與已去除血細(xì)胞的血漿 混合進(jìn)行凈化，考察凈化劑濃度(CPA)對血漿脂蛋白 

實_驗中觀察到，在一定pH壞境下，隨凈化劑 濃度增大，血漿TC及LDL凈化率增加。在體系 pH=5.20時，隨著凈化劑溶度增大至2,500mg/L，可 使TC下降40%左右，LDL和VLDL下降45%左右， 而對HDL的清除率小于25%，并不顯著。這是由 于LDL和HDL的載脂蛋白的種類、組成及空間結(jié) 構(gòu)存在較大差異所致。LDL的載脂蛋白為apolipopr- otein-B(Apo-B)，Apo-B富含賴氨酸、精氨酸和組氨 酸等堿性氨基酸殘基，且多暴露于載脂蛋白表面。 而 HDL 的載脂蛋白為 apolipoprotein-A(Apo-A)，亦 含有一定量的賴氨酸，但其暴露在HDL分子表面的 比率較小。HDL等電點低于LDL，故在相同pH環(huán) 境下，HDL所帶的正電荷比LDL少，其與聚陰離 子形成不溶性復(fù)合物的能力較LDL低。當(dāng)體系 pH=5.20近似于LDL的等電點時，隨著聚陰離子降 解黃原膠羧甲基化衍生物的加入，可以促使其聚 沉。另外，LDL的分子質(zhì)量及尺寸均較HDL大， 在等電點處更容易聚集。

此外，F(xiàn)ib是一種纖維狀蛋白質(zhì)高分子，其等 點電約為pH=5.5。當(dāng)體系pH值低¥其等電點時， Fib整體帶正電荷，容易與聚陰離子形成復(fù)合物絮 凝沉淀出來。通過實驗發(fā)現(xiàn)，體系pH=5.10以及體 系pH=5.20時，凈化劑溶度分別為l,500mg/L、2,000 mg/L、2,500mg/L時，在所取上清液中加人適量的 亞硫酸鈉溶液均沒有形成沉淀，表明此時Fib的清 除率接近100%。

2.3.2凈化體系pH對血漿脂蛋白凈化效果的影響 凈化體系pH是影響凈化劑誘導(dǎo)沉淀LDL及Fib 的另一個重要因素，在凈化劑濃度一定的條件下， 改變凈化體系的pH值，考察其對血液凈化效果的影 響，結(jié)果如圖6所示。

由圖可得：隨著pH下降，TC、LDL及Fib 的清除率將提高。這是由于體系pH環(huán)境決定了血漿 蛋白質(zhì)的荷電數(shù)，故對蛋白質(zhì)與凈化劑相互作用有 重要的影響。在pH低于5.1后的HDL及TP的清除 率都較高，所以選取PH=5.20作為凈化的優(yōu)化pH 值，在此體系下可大幅度清除TC、LDL,而對TP 及HDL的清除率并不顯著。 

 

pH

圖6凈化體系pH對血漿凈化效果的影響(n=5)

2.4.3凈化效果測定體系下，對15個血漿樣本進(jìn)行凈化實驗，凈化結(jié)

取凈化劑濃度為2,500mg/L/在pH=5.20的凈化果如表3所示。

表3降解黃原膠羧甲基化衍生物對血漿中脂蛋白的凈化效果(n=l5)

TCHDL-CLDL-CTP

凈化前(mg/dL)121.4 ± 16.340.6 ±5.180.9 ± 14.559.2 土 7.1

凈化后(mg/dL)75.1 土 10.529.9 ± 4.943.9 ± 8.850.7 土 6.7

清除率39%24%46%14%

 

3結(jié)論

以黃原膠為原料，首先進(jìn)行酸降解，再以氯乙 酸為羧甲基化試劑，對其進(jìn)行羧甲基化，可以獲得 降解黃原膠羧甲基化衍生物。通過正交實驗得到： 降解黃原膠的優(yōu)化條件為酸濃度為〇.15mol •!/、 60T水浴加熱2h，使其分子質(zhì)量降到兩萬以下，羧 甲基化反應(yīng)的較優(yōu)條件為反應(yīng)溫度50丈，干法制 備，直接加人固體的氫氧化鈉，氫氧化鈉與氯乙酸 的比值為2:1.8。

以這種新型降解黃原膠羧甲基化衍生物為凈化 劑，研究其選擇凈化血液低密度脂蛋白(LDL)及纖 維蛋白原(Fib)的性能，得到較優(yōu)凈化條件為：體系 pH=5.20,凈化劑濃度為2,500mg/L時，可使TC下 降40%左右，LDL和VLDL下降45%，F(xiàn)ib下降接 近100%，而HDL和TP下降小于25%，無顯著變 化。說明降解黃原膠衍生物具有良好的選擇凈化性 能，是一種新型LDL/Fib凈化劑。

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