全世界每年大約形成1000?2000億t植物有機(jī)物質(zhì)，其中有一半是纖維素物質(zhì).我國每年 僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘?jiān)ǖ静荨⒔斩挼龋?就約有7億t，工業(yè)生產(chǎn)中還有數(shù)百萬噸的纖維 素廢棄物.這些廢棄物即沒有得到充分的利用，又污染環(huán)境，因此合理開發(fā)和科學(xué)利用這一豐厚 的天然資源是各國政府及科學(xué)家一直致力于且投 入大量資金及人力進(jìn)行研究開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域.目 前對農(nóng)作物秸稈的利用還未達(dá)到令人滿意的水 平，其主要原因是缺乏對農(nóng)作物秸稈這種天然纖 維素完全降解的高活性菌株.本文通過在自然環(huán) 境和秸稈降解物中大量采集和篩選后得出3種優(yōu) 良菌株，并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)木霉 與青霉菌株混合培養(yǎng)后具有纖維素酶的高產(chǎn)協(xié)同 作用，為玉米秸稈中纖維素的有效降解提供一條 新的途徑.

1材料與方法

1.1材料

大興安嶺地區(qū)土壤及腐木、玉米秸稈的降解 物，上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的粘度為800 ~1 200 的羧甲基纖維素鈉（CMC -Na)，玉米秸稈粉碎成 鋸末狀.

培養(yǎng)基：

初篩培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗 糖20 g，瓊脂15 ~18 g，水1 000爪1、只值自然）.

復(fù)篩培養(yǎng)基：CMC - Na 10 g，（ NH4 )2SO4 4 g， KH2PO4 2 g，MgSO4 • 7H2O 0.5 g，蛋白胨 1 g，瓊脂 16 g，蒸餾水 1000 ml.

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC - Na 10 g，(NH4)2SO4 4 g， KH2PO4 2 g，MgS〇4 • 7氏0 0.5 g，蛋白胨 10 g，麥芽汁 10 ml，水 1 000 ml.

1.2方法

1.2.1纖維素分解菌的分離與純化：將采集樣品 按照常規(guī)的稀釋分離法分離真菌并純化，接種于 以玉米秸稈粉為主要基質(zhì)的固體培養(yǎng)基中，在30 ~35 C條件下培養(yǎng)15 d觀察菌的生長狀況及培 養(yǎng)基的變色程度，選取菌株生長快、培養(yǎng)基變色程 度大的菌株作為纖維素分解菌，將該菌株接種于 以羧甲基纖維素鈉（CMC - Na)為唯一碳源的固 體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)菌絲的生長速度及 CMC - Na的液化程度，選出纖維素降解菌的優(yōu)良 菌株.

1.2.2纖維素分解菌的單獨(dú)與混合發(fā)酵培養(yǎng):取 250 ml的錐形瓶，裝入100 ml的培養(yǎng)基，并以體 積比為15%的接種量接種，使其活菌數(shù)達(dá)到1 X 109/m1，于30 °C、200 r/min的搖床震蕩培養(yǎng)，每 隔24 h測量CMC酶活.

1.2.3!-1，葡萄糖酶液（CMC酶）制備與酶

活力測定方法：培養(yǎng)液經(jīng)3 000 r/min離心10 min,上清液為粗酶液，取0. 1 ml上清液加入1.9 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC - Na溶液，在50 C下 水解20 min,加入1. 5 ml DNS進(jìn)行沸水浴10 min,定容至25 ml,在520 nm處比色.在上述條 件下產(chǎn)生1 "mol/min還原糖所需的酶量為個(gè) 酶活單位(u)[1].

1.2.4羧甲基纖維素酶相對活性測定:將纖維素 分解菌株在PDA培養(yǎng)基上單獨(dú)或混合培養(yǎng)48 h 后，用1 cm2打孔器打孔轉(zhuǎn)接在復(fù)篩培養(yǎng)基上生 長，每隔24 h測量其溶解圈的直徑，取平均值計(jì) 算CMC酶相對活性A[2].

A =溶解圈的直徑（cm)/菌體的培養(yǎng)時(shí)間（d) 1.2.5粗纖維利用率的測定:用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8% 的甲酸溶液處理降解剩余物，然后用定性濾紙過 濾，過濾時(shí)用蒸餾水分?jǐn)?shù)次沖洗，將濾紙置于50 C下烘干至恒重[3].

1.2.6纖維素分解菌的單獨(dú)或混合培養(yǎng)對玉米 秸稈降解的影響：取玉米秸稈粉100 g裝入1 000 ml燒杯中，將菌種按1: 10接入秸稈粉中，于28 C觀察其降解速度和表觀變化，共觀察30 d.

2結(jié)果

2.1纖維素分解菌的分離篩選與純化

按照“培養(yǎng)！分離單菌落！純化！初篩！復(fù) 篩”的方法，在大興安嶺地區(qū)的土壤、腐木及玉米 秸稈的降解物中分離到3種可對纖維素進(jìn)行有效 降解的菌株.經(jīng)初步鑒定，該3種菌株分屬于木 霉屬（Trichoderma. sp )、曲霉屬（Aspergillus. sp )、青 霉屬（Penicillium. sp).

2. 2纖維素分解菌的單獨(dú)或混合培養(yǎng)對纖維素 酶活力的影響

將纖維素分解菌進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，其處 理組合如下所示：A木霉、B 青霉、C

曲霉、D——木霉+青霉、E——木霉+曲霉、 F——木霉+青霉+曲霉.將6種處理組合分別 接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每隔24 h測量CMC酶 活，結(jié)果如表1所示,72 h時(shí)CMC酶活的差異顯 著性分析如表2所示，其CMC酶活的動(dòng)態(tài)變化曲 線如圖1所示.

表1纖維素降解菌株（群）在不同培養(yǎng)時(shí)間的纖維素酶活力

Table 1 Cellulase activity of strains at different culture time(u)

菌株/群t/ h

487296120144168216

A0.2132.2072. 4132. 4482. 4672. 5512. 222

B0.1830.1600. 2820. 1680. 8091. 4130. 886

C0.0981. 4541. 8482. 1312. 2302.1541.818

D1.6193. 1162. 8902. 9182. 9172. 9182. 788

E0. 9011. 7562. 1772. 2992. 3272. 3292. 253

F1. 2662. 0002. 3002. 3922. 5892. 6272. 100

表2不同處理組合在72h時(shí)纖維素酶活顯著性分析 Table 2 Significance difference analysis between strains

 

after 72 h culturing

菌株/群72h時(shí)纖維素酶活/u顯著性分析

5%1%

D3.116aA

A2. 207bB

F2. 000bcBC

E1. 756dCD

C1. 454dCD

B0. 160eE

注：SR測驗(yàn)對不同菌株（群）處理組合纖維素酶活在！ =0.05，！ = 0.01水平顯著性分析的多重比較

由表2中可以得出在發(fā)酵培養(yǎng)72 h時(shí)D處 理的CMC酶活同其他處理比較為差異極顯著，A 除了與F相比較為差異不顯著，同其他處理比較 均為差異極顯著.由圖1所示可得出A、D處理 在發(fā)酵培養(yǎng)72 h后就出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，雖然在后期 A處理的CMC酶活有所上升，D處理的CMC酶 活有所下降，但仍高于其他處理組合且變化平穩(wěn). E、F處理在發(fā)酵培養(yǎng)96 h時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，后期 同A處理相比較無明顯差異，但要優(yōu)于B、C處理 的產(chǎn)酶效果，B、C處理分別在發(fā)酵培養(yǎng)144、168 h 時(shí)才出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，但B處理的CMC酶活是最 低的.上述結(jié)果表明某些菌株混合培養(yǎng)的CMC 酶活要明顯強(qiáng)于該菌株的單獨(dú)培養(yǎng)，其中木霉同 青霉的混合培養(yǎng)就是一個(gè)明顯的優(yōu)勢效應(yīng)，它與 青霉單獨(dú)培養(yǎng)的CMC酶活相比較可達(dá)到差異極 顯著.木霉與曲霉，木霉與曲霉、青霉的混合培養(yǎng) 雖然同木霉相比差異較小，但比曲霉、青霉的單獨(dú) 培養(yǎng)有較好的效果.

2.3纖維素分解菌單獨(dú)或混合培養(yǎng)的CMC酶相

對活性比較

由表3中得出在以CMC為唯一碳源的篩選

平板上，D處理生長迅速，接種24 h后即可生長， 72 h后鋪滿平板，但與A相比液化CMC較慢;A、 E、F可使CMC迅速液化，同B、C相比生長速度 較快.E、F在培養(yǎng)48 h時(shí)的CMC酶相對活性略 低于A，但由圖2中可以得出其后期差異不明顯.

表3不同菌株（群）在CMC篩選平板上培養(yǎng)48 h后的

生長狀況

Table 3 Development status of colony after 48 hours

菌株/群溶解圈直徑平均值/cmA/ cm • d-1

A7.153. 58

B2. 401.20

C3.101. 55

D8. 254. 13

E6. 503. 25

F6.503. 25

圖2不同處理在篩選培養(yǎng)基內(nèi)菌圈的擴(kuò)展面積 Fig. 2 Spread area of mycelium of different treatment

2. 4纖維素分解菌單獨(dú)或混合培養(yǎng)對秸稈降解 的影響

表4表明所選菌株均可以不同程度地降解玉 米秸稈中的纖維素，但木霉與青霉的混合培養(yǎng)表 現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，可以提高纖維素的降解量. 玉米秸稈中的纖維素被部分降解后其顏色由黃色 轉(zhuǎn)為棕黑色和黑色，并產(chǎn)生較強(qiáng)的粘滑感，其中顏 色和粘滑感是有機(jī)質(zhì)含量和降解后產(chǎn)糖的一個(gè)直 觀標(biāo)準(zhǔn)，而且加入木霉與青霉混合菌培養(yǎng)的玉米 秸稈在經(jīng)過30 d發(fā)酵后已降解至原來體積的 32% ,而單獨(dú)加入曲霉和青霉的玉米秸稈則為原 來體積的45%左右，說明加入混合菌株可以加速 玉米秸稈的分解速度.

表4不同時(shí)間降解程度觀察 Table 4 Degradation of straw at different time

菌株（群）粗纖維殘余量/%體積減少量/%變色程度

A3660黑色

B5254棕黑色

C5155棕黑色

D3268黑色

3結(jié)論與討論

(1)所篩選的3種菌株均能較大程度的降解 纖維素，說明這些菌株具有產(chǎn)生纖維素酶的特性， 或者具有合成這類胞外酶的基因；如將這類野生 型菌株進(jìn)一步遺傳改造，將會(huì)更大程度的加速纖 維素的降解，為秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物的有效開發(fā)利 用提供優(yōu)勢微生物菌種資源.

(2)目前國內(nèi)外對分解纖維素能力較強(qiáng)的木 霉及其酶活性的研究較多，世界上所選育出來的 優(yōu)良纖維素分解菌幾乎都是木霉屬菌株，而木霉 菌普遍缺乏一種限制因子——葡萄糖苷 酶[4’5]，這可以使纖維二糖積聚，從而反饋抑制酶 活，降低酶解效率，影響纖維素水解為葡萄糖.近 年來，許多研究者在改進(jìn)纖維素酶系組成方面做了 大量的工作;通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成、改進(jìn)菌種的 組成來提高葡萄糖苷酶的活性[6].現(xiàn)在有關(guān) 木霉與曲霉、青霉的混合菌培養(yǎng)降解纖維素以及它 們之間相互作用機(jī)理報(bào)道較少;本文篩選了 3株纖 維分解能力較強(qiáng)的菌株，并對木霉、曲霉、青霉的混 合培養(yǎng)的產(chǎn)酶及降解能力作了初步的探討.

(3)自然狀態(tài)下，纖維素的徹底降解是在微 生物體系中多種微生物長時(shí)間相互作用的結(jié)果， 這一過程僅靠一種微生物是無法實(shí)現(xiàn)的.這是由 于分解纖維素的酶是由多種組分組成的酶體系. 因此，在進(jìn)行纖維素大分子降解的研究過程中要 考慮到微生物的產(chǎn)酶體系之間的協(xié)同效應(yīng).本實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果表明木霉與青霉的混合培養(yǎng)具有最大的 協(xié)同效應(yīng)，木霉同曲霉二者混合，木霉同曲霉、青 霉三者混合的培養(yǎng)效果與木霉單獨(dú)培養(yǎng)無明顯差 異，但比曲霉及青霉的單獨(dú)培養(yǎng)效果顯著，這也許 是因?yàn)榍沟慕到猱a(chǎn)物可以抑制木霉的產(chǎn)酶效 果，或與混合接種的時(shí)間、接種量有一定的關(guān) 系[7].

(4 )在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間的不同對 產(chǎn)酶的影響較大，木霉與青霉的混合培養(yǎng)在72 h 時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰，而后在近100 h內(nèi)一直保持比 較平穩(wěn)的變化，木霉同曲霉二者混合，木霉同曲 霉、青霉三者混合在96 h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰，而后 略有上升或下降，這為菌種產(chǎn)酶時(shí)間的確定提供 了一定的理論依據(jù)，防止在實(shí)際生產(chǎn)中錯(cuò)過最佳 的產(chǎn)酶時(shí)機(jī).