中圖分類號(hào)：^579.r〗文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A魚類繁殖是在下丘腦-腦垂體-性腺軸（HPG軸）的控制下完成的，類固醇激素在其中起重要作用。 性類固醇激素能通過正反饋刺激性未成熟魚的f丘腦和腦垂體分泌GnRH和G(H,啟動(dòng)HPG軸的功能，刺 激性腺發(fā)育11.大多數(shù)硬骨魚類性腺發(fā)育初期分泌類固醇的能力很低，性腺對(duì)GiH不敏感，用外源類固醇 激素可加速HPG軸的啟動(dòng)和發(fā)育[2].性類固醇激素在魚類性反轉(zhuǎn)中起很重要的作用w .直接注射或投喂 外源性類固醇激素，會(huì)很快被代謝清除，且須反復(fù)注射或投喂，對(duì)魚刺激大。也浪費(fèi)藥品。若用性類固醇激 素的緩釋制劑，則可在加快魚性腺發(fā)育的同時(shí)，減少操作次數(shù)，減輕對(duì)魚的刺激，節(jié)約藥品。這對(duì)生產(chǎn)足很 有意義的。

 

在魚類催熟方面，微囊制劑尚無研究。本研究試圖以明膠（Glaiin，GT)和羧甲基纖維素鈉丨細(xì)—咖 boxyraethy celUse，CMC)研制一種廉價(jià)的含類同醇激素的微囊制劑，以達(dá)到減少操作次數(shù)、減少藥品用S、 降低成本的S的。

 

1材料與方法1.1藥品與儀器晶體輩翻了65〖<^1611：，11(；，1)(8丨§1113公司，1^)，用氣流粉碎法制成微粉，90%的微粉直徑小于10(^11;硫 故鈉(分析純，汕頭化學(xué)試劑廠）；冰醋酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；明膠(3?^3公司）；羧甲基纖維素鈉 (湖洲化工廠）；甲醛(分析純，廣州化學(xué)試劑廠）;無菌雙蒸水;磁力攪拌器(上海司樂儀器廠）；分光光度計(jì) (Phanmcia LKB Ullrospec H);冷凍干燥器（FTS,SYSTEMS, INC). i.2微囊的制備1.2.〗制備工藝用復(fù)凝聚法T藝制備。（1)將GT與CMC溶于適量的無繭雙蒸水中，待完全溶解后以一 定的比例混合。（2)將類固醇激素微粉在磁力攪拌器的不斷攪拌下懸浮于r/r-CMC的混合溶液中。（3)在一定溫度T ,滴加10%的冰醋酸溶液至PH值為4左右，并在顯微鏡下觀察成索情況。成賽后，加卜2倍體 枳的蒸餾水，以改善囊形。(4)冰浴冷卻到20 t以下，加人與明膠等量(W/W)的甲醛，攪拌20 min. (5)加人 10%的Na〇H溶液至pH值為8 ~ 9,固化45 min. (6)用無菌雙蒸水洗微囊至無甲醛（Shiff試劑檢測(cè)不變 紅），冷凍干燥得微囊或直接配成制劑。

 

1.12 i交設(shè)計(jì)為獲得較高含藥量和包囊率的微囊，本研究以T為囊心物，將T與明膠用量固定為1:3, 對(duì)制備工藝進(jìn)行r正交設(shè)計(jì)。在反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有條件，確定主要考察因素及其范圍為：GT濃 度 1 %、3% , CMC 濃度 0.3% ~ 0.9% , CMC 溶液：GT溶液(V/V) 1:1-〗，成囊溫度 50 ~ 60 t.

 

將上述4個(gè)因素分為3個(gè)水平(見表丨），選擇正交設(shè)汁實(shí)驗(yàn)表M34 )，將表1的因素和水平數(shù)值按表2 安排實(shí)驗(yàn)/母?jìng)€(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)重復(fù)3次，測(cè)每次制備的T微愛的包囊率，越高越好。

 

表I因素和水平因素水;r:03CT濃度/%123CMC濃度0、30.60-9CMC溶液：CT溶液1:1!：21:3成盎溫度八：505560表2正交實(shí)驗(yàn)表m ~一文驗(yàn)號(hào)ABCD囊率/%12341!(0U0.3)lO-.l)1(50)42.92id)2(0.6)2(1：2)2(55)53.23KD3(0.9)3('1：3)3(60)43.442(2)I{0.3)2(1:2)3(60)42.352(2)2(0.6}3(1:3〉1(50}51-962(2)3(0-9)1(1:1)2(55)57,113(3)1(0.3)3(1:3)2(55)52.2%3⑶2(0.6)1(1:1)3(60]68.493(3)3(0-9)2(3：2)K50)56.77\139.5137.4168.4151.57n15K3m.5152.2162.5T=1 892.4T,]77.3157.1147.5154A,46,545.836.1SO. 5A'；50,457.850.754,159.15349.1R-12.6-126.93.6由表2中《值的結(jié)果可知，影響包賽率最大的因素是G1?和CMC的濃度（11分別為12.ft和12),r；T溶液濃度在3%時(shí)較好，而CMC洛液的濃度在0.6%時(shí)較好;其次是GT溶液與CMC溶液的阼枳比，以 1:!時(shí)較佳;溫度雖對(duì)包褒率的影響較小（I ? I =3.6),何不能忽視，以55 T：時(shí)較好。根據(jù)表2正交設(shè) 的結(jié)果，選擇優(yōu)化組合為：A3,B2, Cl,D2;由于選出的纟且合不在it交試驗(yàn)表中，需再進(jìn)行試驗(yàn)，確定選出的 組合是否較優(yōu)。按選出的組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明T的平均包費(fèi)率為71.8%，說明所選出的組合優(yōu)于K它 組合。本研究后面的實(shí)驗(yàn)所用微囊均是按優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方案制備的。

 

1.2.3微褒許射液的組成將微囊懸浮于含0.〇〇〇 5%的醋酸苯隸〈抑尚荊），0.9%的NaCl(等滲調(diào)節(jié)劑）， 0.5%的羧甲基纖維素鈉(促懸剌）和0.1%的吐溫-80(分散劑）的無菌雙蒸水中，按要求稀釋至所需含最， 分裝于K5 mL離心管中備用(用于含最測(cè)定或體外釋放的不加抑菌劑等附加劑），部分注射液分裝后，置 100 t恒溫箱中滅菌20 min.

 

1.3微囊的形狀及粒徑分布在光學(xué)昆微鏡下觀察微囊的形態(tài)并拍照。用校正過的帶目鏡測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡測(cè)微囊的囊抒大小 與分布，計(jì)數(shù)3批，每批600個(gè)微囊，取3次計(jì)數(shù)的均值。

 

1.4微驀的載藥霣、包裹率及回收率1.4.1含1測(cè)定方法的建立將適量T溶解在無水乙醇中，用分光光度汁在200 ~ 500 nm范圍內(nèi)檢測(cè)(AA =1)，T的最大吸收波長(zhǎng)在紫外光區(qū)240 nm處。精密稱取T適最，用無水乙醇溶解并稀釋到100 mL,分別 取1.1.25.1.5,1.75,2,2.25,2.5 mL,再分別稀釋至10 mL,用分光光度計(jì)在240 nm處測(cè)定吸光度(取3 ?欠 平均值將測(cè)得的吸光度，4對(duì)相應(yīng)的濃度C作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度《mg/Q對(duì)吸光度，1作回歸處理， 得丨 aJ 歸方程：宰匪I Cf/ing/L) = 20.6A + 0.006r =0.999 9,線性范圍 0.05 - 20 mg/L-】。4.2藥物含t及包費(fèi)率■定精密稱取一定量的T,按以上方法包機(jī)后，冷凍干燥16 h ^ ,置稱*瓶中 在&0<干燥器中WT-燥至恒重(24 h重量變化不超過0.2%).微囊稱重后加無水乙醇25 mL,用超聲波處 理]0 mm. 100 T水浴破壞丨h(huán)后，于80 T：加熱提取24 h,冷卻后000 g離心，將沉積的微囊再用25 mL無 水乙Sf提取，如此反復(fù)2?3次，至提取液在240 nm處無吸收峰。合并提取液，用0.8微孔濾膜過濾，fl加無水乙醇至一定體積;取濾液I mL置50 mL容量瓶中定容，用紫外分光光度計(jì)在240處測(cè)定吸光度，冉銀據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微囊載藥量及包裹率_載藥最計(jì)算公式為：載藥量=測(cè)得藥量/微囊總重量x 100% .

 

為考察背景對(duì)測(cè)定是否有于擾，將不含類同醇激素的空H f:M,GCM按同樣方法處埋后。加入適量的 T.再測(cè)定其含量。

 

I'.4.3方法回收率測(cè)定精密稱取T適量，加入一系列含藥量已知的微囊中，按上述含藥量測(cè)定方法操 作。測(cè)回收率。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3次，取平均值。

 

1.5微囊注射液的穩(wěn)定性檢測(cè)將TGM樣品3批分別在冰箱(3~5 T)和室溫（丨2?35 T：)放置，f 3,6,12,]5，18個(gè)月取樣，在顯微鏡 下觀察其形態(tài)并測(cè)定載藥量。

 

1.6體外釋藥實(shí)驗(yàn)情密吸取T，ADSD,MT微囊注射液I mL(激索含屋皆為10 g/L),置4層厚的茶葉袋中，緊密封U后，投 入具塞的三角瓶，以30%(V/V)的乙醇50 mL為釋放介質(zhì)。將樣品瓶放人37 ± 1 t的恒溫水平震蕩器（100 次/min)，以-定時(shí)間間隔取樣，同時(shí)加人同體積的新鮮介質(zhì)。樣品在A為250 nm或245 nm處測(cè)定吸光度， 用際準(zhǔn)曲線il'算釋藥景(減力空□值），共測(cè)定3批，取平均值。換算為累積釋藥百分率后對(duì)時(shí)間作同寸 將T,ADSD,MT的標(biāo)準(zhǔn)品裝人透析袋中，同樣投人盛乙醇的三角瓶，作為對(duì)照。共處理2〗rf.

 

1.7魚類催熟實(shí)驗(yàn)1.7.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物塘養(yǎng)日本鰻鱺分別于1999年4月及1999年12月購fj廣州番禺，其中雌鰻10尾，體重范 ?50 ~ 640 g,體長(zhǎng)范圍65 ~ 84 cm.雄鰻10尾，體重范圍290 ~ 480 g,體長(zhǎng)范圍54 ~ 67 cm.魚蓄養(yǎng)在1 m x 0_5 mx 0,5 m的循環(huán)水族箱中，鹽度3.1%?3.4%,水溫丨2-25】。7.2激索處理雄綬注射微囊劑量為20B.W，雌鰻注劑量為30丨屯/g B.W,對(duì)照組注射不含類固醇激素的微表，注射間隔為25 d，共注射4次。

 

1.7.3注射類固醇激素微費(fèi)對(duì)鰻鋪性腺發(fā)育的影響鰻鱺在注射微賽后105 d,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照紺的魚全 合解剖，取性腺，計(jì)算GSI.

 

1.8數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)f■均值之間的差異用Sludail’sT檢驗(yàn)，2個(gè)以上平均值之間的差異用 丨kmran’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)。尸小于0.05認(rèn)為差異昆苫r表;T、），P小于0.01 T ?表示)認(rèn)為差異極顯著。

 

2結(jié)果分析2.1微囊（由優(yōu)化后的工藝制備而成)的囊徑與表面形態(tài)微*注射液用肉眼觀察為白色乳狀，光鏡下TGM為邊緣透明的白色球形，中間黑色的為囊心物。大多 數(shù)微囊直徑在17?42^^的范圍內(nèi)，平均囊徑為29.5 p? (平均*徑計(jì)算公式：/)為平均囊徑，為單個(gè)微囊的直徑），能順利通過S號(hào)針頭，具有較好的通針性。

 

2.2載藥置、包#率與回收率表3所示的是背景對(duì)明膠-羧甲基纖維素鈉微嚢中睪剛回收率的影響。由表3可看出，無論背景中微 *含量是高是低，經(jīng)過濾后，對(duì)T含量的測(cè)定基本不產(chǎn)生干擾。微棄的載藥最、包濩率與回收率如表4和表 5所示。

 

表3不同背景對(duì)睪S回收率的彩響寧白微球M/mg類間醇加人量/邱平均實(shí)測(cè)叫 平均回收半。/ %CV/%202302?3.0 101.40.2540250248.7 99.70.4380250255.5 1CU,60.76表4微齏載藥■及包裹率測(cè)定結(jié)果表5回收率試驗(yàn)結(jié)果S,[t pi測(cè)定次數(shù)項(xiàng) a結(jié) 果I23測(cè)定次數(shù)4投藥爭(zhēng)/g0,30000.305 80.295 2樣品重Ang100測(cè)得藥UVg0-2]3 80.222 60.210 2含藥量17.92微泰總重量/s1.21031.265 41.241 3類四醇加人鎮(zhèn)10.0藥物含量/%17,6717.5916.93平均含蚩17.4士0.41平均翔得t/mg26.87*0.48包裹率71.372,871.2平均問收率96.23 s 1.71平均包裹率/%7I.S±0.9CV/%1.822.3微驀藥物的體外釋放圖1所示的是微囊制劑在30%乙醇中藥物逐日釋放M,圖2所示的是T標(biāo)準(zhǔn)品累積釋放百分率。由圖 可直觀的看出，類固醇激素微囊化后，釋放速度明顯減慢，T,MT和ADSD標(biāo)準(zhǔn)品在6~ 8 h已釋放90%以 上的藥物，而微囊中的類固醇激素可持續(xù)釋放10 d以上。微索在開始階段釋藥速度都較快，存在突破效 應(yīng)，這可能是吸附在微囊表面及在注射液中的類固醇激素釋放引起的。在以后的時(shí)間里，微囊的每日釋放 量約為330鴻，較穩(wěn)定。

 

將釋藥數(shù)據(jù)分別用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、-級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuchi方程。Hixon - CroweU立方根方程及Baker - Lons?dale 方程處理，發(fā)現(xiàn)微囊中睪酮的釋放數(shù)據(jù)用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程表示相關(guān)系數(shù)最好。TGM 每口釋放量分別為 3.3%,釋放速度較穩(wěn)定，釋放的tl/2分別為12.4 d.雖然微囊內(nèi)藥物的體外釋放情況不一定代表體內(nèi)釋放 情況，但體外釋放情況可作為體內(nèi)釋放的參考，并作為篩選微產(chǎn)制備工藝及監(jiān)測(cè)微囊質(zhì)量的指標(biāo)。

 

2.4微囊注射液的穩(wěn)定性T微囊放置在不同的溫度后，其形態(tài)及含量的變化如表6所示。從表中可看出，未經(jīng)過高溫處理的微 囊無論是放置在冰箱中或是室溫中，1.5 a后仍保持完好的嚢形，藥物含量基本無變化，說明以GT-CMC 為囊樹的微囊注射液可室溫長(zhǎng)期放置。而經(jīng)過100 t滅菌處理的微索，室溫放置的在9個(gè)月后開始蝕解， 12個(gè)月時(shí)已蝕解50%左右，到丨5個(gè)月已完全蝕解;經(jīng)高溫處理的微囊在冰箱放置時(shí)，其蝕解時(shí)間比室溫 放置的晚3個(gè)月，故微囊經(jīng)過100 T滅菌處理后，應(yīng)放冰箱保存，并盡快使用。

 

表6 TCM放置在不同溫度后形態(tài)及含量的變化及 J03€9121518文I 來  ?— — —冰箱#溫冰筘常溫0 形awMy%完%幣整0.420.4217.32 ± 17.32?0.420.42完整完整完完完?€整整完T￡完完整幣整m17.45±\i.n±m0.530.470.4S0.3417.46±17.54土17,39±17.37-0.610.550.470.4&M兀整兀整蝕解20% ~ 40%幣蝕解\0%~完整蝕解50% ~30%80%17.1B±17.58±17.3&1\1.%±0.370.4S0.540.3917.12±17.44±0.5]0.26n,29±0.4517.16±0.58解& %解%上 蝕I90蝕90以-整-"兒整完整m0.6117.42*0.52蝕解兌全蝕解W 、 BA HA B- A BA BA BAB注A表示未經(jīng)過高溫處理的表示結(jié)過！00 1C處理的微典2.5親魚性腺發(fā)育狀況雄鰻在注射含睪酮的微囊制劑后GS1為(3.7± 1.56)% ?-，較對(duì)照組(0.18 ± 0? 11)%増加，20.5倍。 實(shí)驗(yàn)組成熟率達(dá)到80%，而對(duì)照組無成熟的鰻鱺。由表7可看出，經(jīng)過類固醇激素微囊制劑i〇5 d的處理， 雌鰻的GS1有極顯著的增加。

 

表7雌鰻的CSI及CSI的分布(n=IO)

 

分組平均WGSI < 10% 的尾數(shù)10% < GSI < M 的尾數(shù)25% <GS1<40% 的尾數(shù)GSf>40%的尾數(shù)最低GSIm€S1玄驗(yàn)芻i U 二 10)19?± 1]"334Q4,23汨。4(n = 6)0.93 土 a?760000/341.213討論本研究所用囊材分別為CT與CMC,都梟常用的藥劑輔料，材料來源廣，價(jià)格便宜。通過均勻設(shè)計(jì)與正 交設(shè)計(jì)找到了較好的制備工藝，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

 

0.]微#形成機(jī)埋及工藝微龔的制備方法是復(fù)凝聚法，即使帶相反電荷的高分子W料相互交連，溶解度降低而析出成囊。所用 #材中GT為蛋白質(zhì)，分子具有較多的_\氏和一COOH及相應(yīng)的離解基團(tuán)一NH3"■和一C00-.所含正、負(fù)離 f的多少受pH值影響，PH值低時(shí)止離子多，而pH值高寸負(fù)離子多。CIWC是半人工合成的陰離子甩高分 子材枓，分7中有較多的一COO-,當(dāng)GT與CMC共處同一溶液中時(shí)，在pH值為4?5的范圍內(nèi)明腔正電荷 達(dá)到最高值，與CMC結(jié)合形成凝聚物而成栽。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GT與CMC的濃度是影響包典平的S要因 素，因?yàn)闈舛扔绊懻扯?，即影響凝聚物流?dòng)性，因此影響了包囊率。在實(shí)驗(yàn)屮還發(fā)現(xiàn)，成囊后，加人適量的蒸 餾水可改善囊形，這可能是巾于加水降低了粘度，改音了流動(dòng)性，降低了界面張力，從而使囊形改善。

 

3.2微囊藥物的體外釋放微*中藥物的釋放機(jī)制有3種。（1)擴(kuò)散，即藥物由進(jìn)人微囊的溶劑溶解后，經(jīng)過囊膜擴(kuò)散到介質(zhì)中， 是物理過程。溶解在*壁或附著在微囊表面的藥物擴(kuò)散則形成釋藥的突破效應(yīng)。（2)囊壁溶解，不包括酶的 作用，是物理化學(xué)過程，囊壁溶解速度取決于囊材性質(zhì)、液體體枳、溫度等因素。（3)囊壁的消化與降解，這 是在酶作用下的生物化學(xué)過程，囊壁被酶降解為其它代謝產(chǎn)物后，藥物釋放出來。

 

3.3類固_激素微囊誘導(dǎo)鰻鱺性腺發(fā)育的效果由結(jié)果可知，間隔25 d注射類固醇激素微囊后，可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)組的雄鰻精巢發(fā)育，平均GSI達(dá)3%以上。 注射類固醇激素微囊后，雌鲅性腺也有較明顯的發(fā)育，平均GSI分別為19.7%.本研究中鰻睡的平均GSI 與用MT和ADSD非包膜型硅橡膠藥條埋植鯪_ 7次的結(jié)果：4]相近。

 

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鰻鱺個(gè)體對(duì)激素的反應(yīng)差別較大，其最高GSI與最低GSI有時(shí)相差幾倍到十幾倍，鰻 鱺對(duì)激素反應(yīng)的差別可能與饅鱺的體質(zhì)、年齡、應(yīng)瀲狀態(tài)、性腺中激素受體的數(shù)量等因素有關(guān)。其中魚的體 質(zhì)較重要，因?yàn)轹狑~在催熟期間不投喂，身體中的物質(zhì)與能量除供應(yīng)性腺發(fā)育外，還要維持基本生命活動(dòng)， 因此應(yīng)選體質(zhì)較好的魚來進(jìn)行催熟。

 

筆者首次應(yīng)用含類固醇激素的微囊制劑誘導(dǎo)鰻_性腺的發(fā)育，與以前的方法比較，將原來每15 d埋 植1次（劑量50fIg/gB.W)變?yōu)槊?5d注射1次（3〇ng/gB.W)，減少了對(duì)魚的刺激，還減少激素丨f]量。微囊 制劑對(duì)雄鰻誘導(dǎo)效果較好，對(duì)雌鰻效果稍差。因此以后還要加強(qiáng)這方面的研究，如微?制劑中激素在魚體 內(nèi)的釋放情況、理想的注射劑量、制備工藝對(duì)微囊催熟效果的影響及微囊制劑在其它魚類的應(yīng)爪等。

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