魚類繁殖是在下丘腦一腦垂體一性腺軸(HPG軸）的控制下完成的，類固醇激素在其中起重要作用。 性類固醇激素能通過正反饋刺激性未成熟魚的下丘腦和腦垂體分泌GnRH和GtH,啟動HPG軸的功能，刺激性腺發(fā)#1].大多數(shù)硬骨魚類性腺發(fā)育初期分泌類固醇的能力很低，性腺對GH不敏感用外源類固醇激素可加速HPG軸的啟動和發(fā)育[2 .性類固醇激素在魚類性反轉(zhuǎn)中起很重要的作用[3].直接注射或投喂 外源性類固醇激素，會很快被代謝清除，且須反復(fù)注射或投喂，對魚刺激大，也浪費(fèi)藥品。若用性類固醇激素的緩釋制劑，則可在加快魚性腺發(fā)育的同時(shí)，減少操作次數(shù)，減輕對魚的刺激，節(jié)約藥品。這對生產(chǎn)是很 有意義的。
在魚類催熟方面，微囊制劑尚無研究。本研究試圖以明膠(Glatin，GT)和羧甲基纖維素鈉(Sodium car- boxymethy celluose, CMC)研制一種廉價(jià)的含類固醇激素的微囊制齊劑以達(dá)到減少操作次數(shù)、減少藥品用量、 降低成本的目的。
1材料與方法1.1藥品與儀器晶體睪酮(Testostelone^ T)(Sigma公司，USA),用氣流粉碎法制成微粉，90%的微粉直徑小于10^m;硫 酸鈉(分析純，汕頭化學(xué)試劑廠）冰醋酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠）明膠(Serva公司）羧甲基纖維素鈉 (湖洲化工廠）甲醛(分析純，廣州化學(xué)試劑廠）無菌雙蒸水;磁力攪拌器(上海司樂儀器廠）分光光度計(jì) (Phamacia IKB Ultrospec 11)冷凍干燥器（FIS, SYSTEMS, INC).
1.2微囊的制備1.2.1制備工藝用復(fù)凝聚法工藝制備。（1)將GT與CMC溶于適量的無菌雙蒸水中，待完全溶解后以一 定的比例混合。（2)將類固醇激素微粉在磁力攪拌器的不斷攪拌下懸浮于GT — CMC的混合溶液中。3)在一定溫度下，滴加10%的冰醋酸溶液至pH值為4左右，并在顯微鏡下觀察成囊情況。成囊后，加1 ~ 2倍體 積的蒸餾水，以改善囊形。（4)冰浴冷卻到20 °C以下，加入與明膠等量(W/W)的甲酸，攪拌20 min. (5)加入 10%的NaOH溶液至pH值為8 ~ 9,固化45 min. (6)用無菌雙蒸水洗微囊至無甲醛(Shiff試劑檢測不變 紅)，冷凍干燥得微囊或直接配成制劑。
1.2.2正交設(shè)計(jì)為獲得較高含藥量和包囊率的微囊，本研究以T為囊心物，將T與明膠用量固定為1 :3, 對制備工藝進(jìn)行了正交設(shè)計(jì)。在反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有條件，確定主要考察因素及其范圍為：GT濃 度 1 % ~3%，CMC 濃度 0. 3% ~ 0.9%, CMC 溶液 GT 溶液(V/V) 1 :1 ~ 1 :3,成囊溫度 50 ~60 °C.
將上述4個(gè)因素分為3個(gè)水平(見表1)，選擇正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表U(34)，將表1的因素和水平數(shù)值按表2 安排實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)號重復(fù)3次，測每次制備的T微囊的包囊率，越高越好。
表1因素和水平因素水平123GT濃度/ %123CMC濃度/ %0. 30.60.9CMC溶液：GT溶液1:11:21=3成囊溫度，〔'505560表2正交實(shí)驗(yàn)表列號 —,平均包實(shí)驗(yàn)號ABCD囊率/%123411(1)1(0.3)1(1 :)1(50)42 921(1)2( 0 6)2(1 :)2(55)53 231( 1)3( 0 9)3(1 =3)3(60)43 442( 2)1(0.3)2(1 :)3(60)42 352( 2)2( 0 6)3(1 =3)1(50)51 962( 2)3( 0 9)1(1 :)2(55)57 173( 3)1(0.3)3(1 =3)2(55)52 283( 3)2( 0 6)1(1 :)3(60)68 493( 3)3( 0 9)2(1 :)1(50)56 7T丨139.5137 4168. 4151.5T151.3173 5152. 2162 5T= 1 892. 4T177.3157 1147. 5154X丨46 545 856 150 5X 250.457 850 754 1X 359 15349 151 3R-12.6-126 93 6由表2中R值的結(jié)果可知，影響包囊率最大的因素是GT和CMC的濃度（|R |分別為12.6和12)， GT溶液濃度在3%時(shí)較好，而CMC溶液的濃度在0.6%時(shí)較好;其次是GT溶液與CMC溶液的體積比，以 1 :1時(shí)較佳;溫度雖對包囊率的影響較?。▅ R | = 3. 6)，但不能忽視，以55 °C時(shí)較好。根據(jù)表2正交設(shè)計(jì) 的結(jié)果，選擇優(yōu)化組合為：A3, B2 C1, D2;由于選出的組合不在正交試驗(yàn)表中，需再進(jìn)行試驗(yàn)，確定選出的 組合是否較優(yōu)。按選出的組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明T的平均包囊率為71.8%,說明所選出的組合優(yōu)于其它組合。本研究后面的實(shí)驗(yàn)所用微囊均是按優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方案制備的。
1.2. 3微囊注射液的組成將微囊懸浮于含0.000 5%的醋酸苯汞(抑菌劑）、0. 9%的NaCl(等滲調(diào)節(jié)劑）、0.5%的羧甲基纖維素鈉(促懸劑)和0.1%的吐溫一80(分散劑）的無菌雙蒸水中，按要求稀釋至所需含量， 分裝于1.5 mL離心管中備用(用于含量測定或體外釋放的不加抑菌劑等附加劑）部分注射液分裝后，置 100 °Gg溫箱中滅菌20 min.
1.3微囊的形狀及粒徑分布在光學(xué)顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)并拍照。用校正過的帶目鏡測微尺的光學(xué)顯微鏡測微囊的囊徑大小 與分布，計(jì)數(shù)3批，每批600個(gè)微囊，取3次計(jì)數(shù)的平均值。
1.4微囊的載藥量、包裹率及回收率1.4.1含量測定方法的建立將適量T溶解在無水乙醇中，用分光光度計(jì)在200~500nm范圍內(nèi)檢測(A入 =1) T的最大吸收波長在紫外光區(qū)240 nm處。精密稱取T適量，用無水乙醇溶解并稀釋到100 mL分別 取1，1.25, 1.5, 1.75,22.25, 2.5mL,再分別稀釋至10mL,用分光光度計(jì)在240 nm處測定吸光度(取3次 平均值）將測得的吸光度A對相應(yīng)的濃度C作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度C(mg/L)對吸光度A作回歸處理， 得回歸方程：睪酮 CV, (mg/L) = 20. 6A + 0.006r =0.999 9,線性范圍 0.05 ~20 mg/L.
1.4.2藥物含量及包囊率測定精密稱取一定量的T,按以上方法包囊后，冷凍干燥16 h后，置稱量瓶中 在P2O5干燥器中再干燥至恒重（4 h重量變化不超過0.2%).微囊稱重后加無水乙醇25 mL,用超聲波處 理10min, 100 °Q水浴破壞1 h后，于80 °C加熱提取24 h,冷卻后1 000 g離心，將沉積的微囊再用25 mL無 水乙醇提取，如此反復(fù)2 ~3次，至提取液在240 nm處無吸收峰。合并提取液，用0. 8 ^m微孔濾膜過濾，再 加無水乙醇至一定體積;取濾液1 mL置50 mL容量瓶中定容，用紫外分光光度計(jì)在240 nm處測定吸光度， 再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微囊載藥量及包裹率。載藥量計(jì)算公式為：載藥量=測得藥量/微囊總重量X 100%.
為考察背景對測定是否有干擾，將不含類固醇激素的空白CM, GCM按同樣方法處理后，加入適量的 T,再測定其含量。
1.4.3方法回收率測定精密稱取T適量，加入一系列含藥量己知的微囊中，按上述含藥量測定方法操 作，測回收率。每個(gè)測定重復(fù)3次，取平均值。
1.5微囊注射液的穩(wěn)定性檢測將TGM樣品3批分別在冰箱（~5 °C)和室溫（12~35 °C)放置，于3, 6, 12 15, 18個(gè)月取樣，在顯微鏡 下觀察其形態(tài)并測定載藥量。
1.6體外釋藥實(shí)驗(yàn)精密吸取T, ADSD, MT微囊注射液1 mL(激素含量皆為10g/L)置4層厚的茶葉袋中，緊密封口后，投 入具塞的三角瓶，以30%(V/V)的乙醇50 mL為釋放介質(zhì)。將樣品瓶放入37±1 °C的恒溫水平震蕩器(100 次/min),以一定時(shí)間間隔取樣，同時(shí)加入同體積的新鮮介質(zhì)。樣品在A為250 nm或245 nm處測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋藥量(減去空白值）共測定3批，取平均值，換算為累積釋藥百分率后對時(shí)間作圖。同時(shí) 將T，ADSD，MT的標(biāo)準(zhǔn)品裝入透析袋中，同樣投入盛乙醇的三角瓶，作為對照。共處理21 d.
1.7魚類催熟實(shí)驗(yàn)1. 7.1實(shí)驗(yàn)動物塘養(yǎng)日本鰻鱺分別于1999年4月及1999年12月購自廣州番禺，其中雌鰻10尾，體重范 圍350 ~ 640 g,體長范圍65 ~84 cm.雄鰻10尾體重范圍290 ~480 g,體長范圍54 ~67 cm.魚蓄養(yǎng)在1 mX 0.5 mX0.5 m的循環(huán)水族箱中，鹽度3.1%~3.4%,水溫12~25 °Q1.7.2激素處理雄鰻注射微囊劑量為20 %/g B. W雌鰻注射劑量為30 %/g B.W,對照組注射不含類固 醇激素的微囊，注射間隔為25 d共注射4次。
1.7.3注射類固醇激素微囊對鰻鱺性腺發(fā)育的影響鰻鱺在注射微囊后105 d將實(shí)驗(yàn)組和對照組的魚全 部解剖，取性腺，計(jì)算GSI.
1.8數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)平均值之間的差異用Student’s T檢驗(yàn)，2個(gè)以上平均值之間的差異用 Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)。小于0.05認(rèn)為差異顯著（表示)，P小于0. 01 (表示)認(rèn)為差異極顯著。
2結(jié)果分析2.1微囊(由優(yōu)化后的工藝制備而成）的囊徑與表面形態(tài)微囊注射液用肉眼觀察為白色乳狀，光鏡下TGM為邊緣透明的白色球形中間黑色的為囊心物。大多 數(shù)微囊直徑在17 ~42 Pm的范圍內(nèi)，平均囊徑為29.5 Pm (平均囊徑計(jì)算公式：D = ^ (d)/ ^ n D為 平均囊徑，d為單個(gè)微囊的直徑)，能順利通過8號針頭，具有較好的通針性。
2.2載藥量、包囊率與回收率表3所示的是背景對明膠一羧甲基纖維素鈉微囊中睪酮回收率的影響。由表3可看出，無論背景中微 囊含量是高是低，經(jīng)過濾后，對T含量的測定基本不產(chǎn)生干擾。微囊的載藥量、包囊率與回收率如表4和表 5所示。
表3不同背景對睪酮回收率的影響空白微球量/mg類固醇加入量/p平均實(shí)測量/p平均回收率/%CV/ %20250253.0101.40.2540250248.799.70.43表5回收率試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)日結(jié) 果測定次數(shù)4樣品重/mg100含藥量/mg17 92類固醇加入量/mg10 0平均測得量/mg26. 87±0. 48平均回收率/ %96. 23±1. 71CV/%1 82表4微囊載藥量及包裹率測定結(jié)果測定次數(shù)項(xiàng)日123投藥量/ g0. 300 00. 305 80. 295 2測得藥量/g0. 213 80.222 60. 210 2微囊總重量/g1. 210 31.265 41 241 3藥物含量/%17 6717 5916 93平均含量/ %17. 4±0 41包裹率/%71 372 871 2平均包裹率/ %71. 8 ±0. 980250255. 5101. 60.762.3微囊藥物的體外釋放圖1所示的是微囊制劑在30%乙醇中藥物逐日釋放量，圖2所示的是T標(biāo)準(zhǔn)品累積釋放百分率。由圖 可直觀的看出，類固醇激素微囊化后，釋放速度明顯減慢，TMT和ADSD標(biāo)準(zhǔn)品在6~8 h已釋放90%以 上的藥物，而微囊中的類固醇激素可持續(xù)釋放10 d以上。微囊在開始階段釋藥速度都較快，存在突破效 應(yīng)，這可能是吸附在微囊表面及在注射液中的類固醇激素釋放引起的。在以后的時(shí)間里，微囊的每日釋放 量約為330作，較穩(wěn)定。
將釋藥數(shù)據(jù)分別用零級動力學(xué)、一級動力學(xué)、Higuchi方程、Hixon — Crowell立方根方程及Baker?—Lons?dale 方程處理，發(fā)現(xiàn)微囊中睪酮的釋放數(shù)據(jù)用零級動力學(xué)方程表示相關(guān)系數(shù)最好。TGM 每日釋放量分別為 3.3 %釋放速度較穩(wěn)定，釋放的t!/2分別為12.4 d.雖然微囊內(nèi)藥物的體外釋放情況不一定代表體內(nèi)釋放 情況，但體外釋放情況可作為體內(nèi)釋放的參考，并作為篩選微囊制備工藝及監(jiān)測微囊質(zhì)量的指標(biāo)。
2.4微囊注射液的穩(wěn)定性T微囊放置在不同的溫度后，其形態(tài)及含量的變化如表6所示。從表中可看出，未經(jīng)過高溫處理的微 囊無論是放置在冰箱中或是室溫中，1.5 a后仍保持完好的囊形，藥物含量基本無變化，說明以GT — CMC 為囊材的微囊注射液可室溫長期放置。而經(jīng)過100 C滅菌處理的微囊，室溫放置的在9個(gè)月后開始蝕解， 12個(gè)月時(shí)己蝕解50%左右，到15個(gè)月己完全蝕解;經(jīng)高溫處理的微囊在冰箱放置時(shí)，其蝕解時(shí)間比室溫 放置的晚3個(gè)月，故微囊經(jīng)過100 C滅菌處理后，應(yīng)放冰箱保存，并盡快使用。
放置條件時(shí)間/月369121518全解 全解完蝕 完蝕完整 完整解，~%解％上蝕°"90蝕90以 6完整 完整解4%解4%蝕 I40蝕 I80 完整 完整完整蘭0%30% 完整 完整完整 完整 完整 完整完整 完整 完整 完整完整 完整 完整 完整 冰箱 常溫 囊形表6 TGM放置在不同溫度后形態(tài)及含量的變化冰箱常溫載藥量％ /17.32 士 17. 32 士17. 53士17. 45 士17. 28 士 17. 41 士17. 18 士 17. 58 士17. 38 士 17. 56 士17. 29 士 一17. 48 士0.420 420. 530 470 480 340 37 0 480 54 0 390. 450. 6117.32 士 17. 32 士17. 46 士17. 54 士17. 39 士 17. 37 士17. 12 士17. 44 士17. 16 士17. 42 士0.420 . 420. 610 550 470 480 510. 260. 580 52注A表示未經(jīng)過高溫處理的微囊；B表示經(jīng)過iro °c處理的微囊2.5親魚性腺發(fā)育狀況雄鰻在注射含睪酮的微囊制劑后031為(3.7±1.56)%<'較對照組(0.18±0.11)%増加了20.5倍。 實(shí)驗(yàn)組成熟率達(dá)到80%而對照組無成熟的鰻鱺。由表7可看出，經(jīng)過類固醇激素微囊制劑105 d的處理，雌鰻的GSI有極顯著的増加。
表7雌鰻的GSI及GSI的分布（n=10)
分組平均GSIGSK 10%10 %CGSK25%25%〈GSK40%GSI> 40 %最低最高的尾數(shù)的尾數(shù)的尾數(shù)的尾數(shù)GSIGSI實(shí)驗(yàn)組 (n= 10)19. 7 士 11 **33404 2333 4對照組0.93 士 0.3760000 341. 213討論本研究所用囊材分別為GT與CMC,都是常用的藥劑輔料，材料來源廣，價(jià)格便宜。通過均勻設(shè)計(jì)與正 交設(shè)計(jì)找到了較好的制備工藝，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
3.1微囊形成機(jī)理及工藝微囊的制備方法是復(fù)凝聚法，即使帶相反電荷的高分子材料相互交連，溶解度降低而析出成囊。所用 囊材中GT為蛋白質(zhì)，分子具有較多的一NH2和一COOH及相應(yīng)的離解基團(tuán)一—⑴O—所含正、負(fù)離 子的多少受pH值影響，pH值低時(shí)正離子多，而pH值高時(shí)負(fù)離子多。CMC是半人工合成的陰離子型高分 子材料，分子中有較多的一C⑴—當(dāng)GT與CMC共處同一溶液中時(shí)，在pH值為4~5的范圍內(nèi)明膠正電荷 達(dá)到最高值，與CMC結(jié)合形成凝聚物而成囊。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GT與CMC的濃度是影響包囊率的重要因 素，因?yàn)闈舛扔绊懻扯?，即影響凝聚物流動性，因此影響了包囊率。在?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，成囊后，加入適量的蒸 餾水可改善囊形，這可能是由于加水降低了粘度，改善了流動性，降低了界面張力，從而使囊形改善。
3.2微囊藥物的體外釋放微囊中藥物的釋放機(jī)制有3種。（1)擴(kuò)散，即藥物由進(jìn)入微囊的溶劑溶解后，經(jīng)過囊膜擴(kuò)散到介質(zhì)中， 是物理過程。溶解在囊壁或附著在微囊表面的藥物擴(kuò)散則形成釋藥的突破效應(yīng)。（2)囊壁溶解不包括酶的 作用，是物理化學(xué)過程，囊壁溶解速度取決于囊材性質(zhì)、液體體積、溫度等因素。（3)囊壁的消化與降解這 是在酶作用下的生物化學(xué)過程，囊壁被酶降解為其它代謝產(chǎn)物后，藥物釋放出來。
3.3類固醇激素微囊誘導(dǎo)鰻鱺性腺發(fā)育的效果由結(jié)果可知，間隔25 d注射類固醇激素微囊后，可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)組的雄鰻精巢發(fā)育，平均GSI達(dá)3%以上。 注射類固醇激素微囊后，雌鰻性腺也有較明顯的發(fā)育，平均GSI分別為19.7%.本研究中鰻鱺的平均GSI 與用MT和ADSD非包膜型硅橡膠藥條埋植鰻鱺7次的結(jié)果[4相近。
在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鰻鱺個(gè)體對激素的反應(yīng)差別較大，其最高GSI與最低GSI有時(shí)相差幾倍到十幾倍。鰻 鱺對激素反應(yīng)的差別可能與鰻鱺的體質(zhì)、年齡、應(yīng)激狀態(tài)、性腺中激素受體的數(shù)量等因素有關(guān)。其中魚的體 質(zhì)較重要，因?yàn)轹狑~在催熟期間不投喂，身體中的物質(zhì)與能量除供應(yīng)性腺發(fā)育外，還要維持基本生命活動， 因此應(yīng)選體質(zhì)較好的魚來進(jìn)行催熟。
筆者首次應(yīng)用含類固醇激素的微囊制劑誘導(dǎo)鰻鱺性腺的發(fā)育，與以前的方法比較，將原來每15 d埋 植1次(劑量50 ^g/g B.W)變?yōu)槊?5 d注射1次(30%/g B.W),減少了對魚的刺激，還減少激素用量。微 囊制劑對雄鰻誘導(dǎo)效果較好，對雌鰻效果稍差。因此以后還要加強(qiáng)這方面的研究，如微囊制劑中激素在魚 體內(nèi)的釋放情況、理想的注射劑量、制備工藝對微囊催熟效果的影響及微囊制劑在其它魚類的應(yīng)用等。