膠原是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，分子中至少應(yīng)該有一個(gè)結(jié)構(gòu) 域具有a-鏈組成的三股螺旋構(gòu)象(即膠原域）[1]。膠原因?yàn)樽陨淼奶厥庑再|(zhì)如低免 疫原性、生物相容性、止血作用、可生物降解性和良好的細(xì)胞基質(zhì)間相互作用而 在在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。但是由于膠原自身機(jī)械性能和可塑 性不足；熱穩(wěn)定性差，不能長(zhǎng)期保存；對(duì)生物降解的耐受性較差，在體內(nèi)降解過(guò) 快，難以與新生組織的生長(zhǎng)相匹配，其應(yīng)用范圍因不能滿足某些生物醫(yī)用材料的 功能性需求而受到較大限制。所以，實(shí)驗(yàn)選用改性羧甲基纖維素鈉（改性CMC) 作為交聯(lián)劑對(duì)膠原進(jìn)行改性，以降低免疫原性，提高力學(xué)性能和適度延緩生物降 解時(shí)間。改性CMC是用高碘酸鹽對(duì)CMC的2、3位羥基氧化斷鏈而得，含有大 量醛基，具有高生物活性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)。借助改性CMC分子中的醛基與膠原上 的活性基團(tuán)反應(yīng)生成席夫堿，使改性CMC分子與膠原蛋白通過(guò)C=N雙鍵緊密的 結(jié)合在一起。實(shí)驗(yàn)采用冷凍凝膠化技術(shù)[2]來(lái)制備凝膠，它可以使生物質(zhì)原料如膠原 等的生物學(xué)效能得到較好維持，不會(huì)發(fā)生高溫、劇烈震動(dòng)、輻射等引起的變性或 降解，還能很好的保持孔狀結(jié)構(gòu)，為研宄生物質(zhì)原料創(chuàng)造了條件。實(shí)驗(yàn)條件容易 控制，對(duì)結(jié)果造成影響的干擾因素減少了，且這一過(guò)程簡(jiǎn)單易行，運(yùn)行成本低。 因此可以說(shuō)冷凍凝膠化是一種適合于制備生物醫(yī)用復(fù)合材料的方法。

　　

　　2.實(shí)驗(yàn)部分2.1試劑冰醋酸（成都科龍化工試劑廠）；胃蛋白酶（HighPurify Grade)(上海華舜生 物工程有限公司）；胰蛋白酶（上海華舜生物工程有限公司）；碳酸鈉（成都科龍 化工試劑廠）；檸檬酸三鈉（成都科龍化工試劑廠)；十二水磷酸氫二鈉（成都科 龍化工試劑廠）；磷酸二氫鉀（成都科龍化工試劑廠）；透析袋（成都金山化學(xué)試 劑公司）；改性CMC (自制）；I型膠原（自制）。

　　

　　2.2改性CMC/膠原冷凍凝膠的制備實(shí)驗(yàn)采用比較成熟的酸-酶法提取I型膠原的工藝，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下提 取。主要步驟包括跟腱預(yù)處理、酶解、過(guò)濾、鹽析和透析5步。制備樣品前，首先測(cè)定膠原的固含量，稱取I型膠原濕樣品5.0?6.0g(m〇)，冷凍干燥稱量（mi)。 膠原固含量=mi/ m〇*100%。其次是配置改性CMC溶液，精確稱取2.0g改性CMC， 加入適量的蒸餾水溶解24h，然后將溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，配置成 2%的改性CMC溶液。并用該溶液稀釋配置0.2%和0.02%的改性CMC溶液，三 種溶液均放置在1°C冷柜中儲(chǔ)藏。然后稱取10.0g的膠原，加入10ml蒸餾水，然 后按照其固含量取不同濃度的改性CMC溶液配制出不同配比的膠原-改性CMC共 混液（100:1、1000:1、5000:1和10000:1)，并不斷攪拌，盡量混合均勻?；旌衔?移入模具后，放置30min減少氣泡，然后在-25C下冷凍7天，然后再進(jìn)行冷凍干 燥即得海綿體，真空冷凍干燥儀（ALPHA1-2LD)為德國(guó)CHRIST所產(chǎn)。

　　

　　2.3傅里葉變換紅外光譜（FT-IR Spectrum)分析包括前期準(zhǔn)備、壓片、開(kāi)機(jī)、自檢、測(cè)樣和記錄等步驟。所用儀器為美國(guó)PE所產(chǎn)。

　　

　　2.4凝膠化測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用稱重法測(cè)定生成物的凝膠含量。不同比例的冷凍凝膠在不同冷凍時(shí) 間下的樣品解凍后，在室溫下將水凝膠浸沒(méi)于0.05 mol/L醋酸溶液中，并以20 r/min 的轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌2h。將浸泡物取出，用蒸餾水仔細(xì)沖洗除去醋酸，放入烘箱中在 室溫下干燥24 h，直至質(zhì)量恒定。凝膠化程度由剩余質(zhì)量比上初始固含量即得。

　　

　　2.5改性CMC/膠原冷凍凝膠的溶脹性能將不同比例的改性CMC/膠原海綿干樣裁剪成1cm見(jiàn)方的薄片，稱得干重后 浸沒(méi)于pH7.4的PBS溶液中。取出水凝膠樣品，用濾紙拭去表面溶液，稱量吸收 溶劑后水凝膠的質(zhì)量，再放回緩沖液。此操作重復(fù)多次，直至溶脹的凝膠質(zhì)量基 本不變，視為到溶脹平衡。同時(shí)記錄凝膠在該種介質(zhì)中的處于不同溶脹情況的時(shí) 間。溶脹度由吸水量比上干重即得。

　　

　　2.6胰酶降解耐受性能凝膠抵抗酶降解的能力通過(guò)酶解反應(yīng)的程度，即酶降解前后凝膠的質(zhì)量變化 進(jìn)行評(píng)估。該實(shí)驗(yàn)選用凍干樣品。不同比例冷凍凝膠干樣裁成1cm見(jiàn)方薄片，在 1%的胰酶-PBS溶液中進(jìn)行酶解反應(yīng)。條件是pH7.4, 37°C和100r/m。每間隔一定 時(shí)間取樣，用蒸餾水沖洗1分鐘、浸泡10分鐘、再?zèng)_洗30秒，盡量除去凝膠中 的降解產(chǎn)物和其他雜質(zhì)（包含胰酶）。放入60C的烘箱中烘干過(guò)夜，稱取酶解后 的凝膠殘留物的干質(zhì)量。

　　

　　2.7血液相容性評(píng)價(jià)材料的溶血性是根據(jù)材料與血液接觸所導(dǎo)致的溶血作用（血細(xì)胞破裂，血紅 蛋白溶入周?chē)后w環(huán)境）的程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的。本實(shí)驗(yàn)選用凍干樣品，凝膠的溶血 性檢測(cè)采用游離血紅蛋白直接測(cè)定法（最初源于O’leary and Guess的實(shí)驗(yàn)方法[3])，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

　　

　　3.結(jié)果與討論圖3.2不同比例的改性CMC/膠原 凝膠與純膠原的FT-IR圖譜3.1傅里葉紅外變換光譜（FT-IR)分析圖3.1為改性CMC的傅里葉變換紅外圖譜，從中可以看到其在1732cm-1處的醛基特征吸收峰，對(duì)比圖3.1和圖3.2,可以看到改性CMC與膠原交聯(lián)反應(yīng)以后， 醛基峰已經(jīng)消失了，說(shuō)明所添加的改性CMC已經(jīng)完全與膠原發(fā)生交聯(lián)，所有的醛 基均已和氨基縮合。不同改性CMC/膠原凝膠與純膠原的紅外圖譜基本一致，原因 可能是由于改性CMC與膠原的配比最低都是1:100，膠原是過(guò)量的。改性CMC基本反應(yīng)完全，所以醛基峰消失了。

　　

　　3.2凝膠化程度評(píng)價(jià)圖3.4不同配比的改性CMC/膠原冷凍凝膠的凝膠含量-時(shí)間關(guān)系曲線改性CMC/膠原凝膠結(jié)構(gòu)中化學(xué)交聯(lián)占主導(dǎo)地位，同時(shí)還存在大量物理交聯(lián)。 通過(guò)醋酸酸解，可以把體系中的物理交聯(lián)基本破壞并洗脫，最終剩下的化學(xué)凝膠 的含量可視為凝膠生成量。

　　

　　從圖3.4中可以看出，不同配比的改性CMC/膠原樣品凝膠的終含量隨改性 CMC的濃度增加而增加；而凝膠含量與冷凍時(shí)間的關(guān)系來(lái)看，冷凍時(shí)間越長(zhǎng)，生 成共價(jià)鍵的交聯(lián)度越高，生成的凝膠越多。1： 1000的比例樣品最終凝膠化程度最 好，而1： 100的比例樣品雖然能夠較早完成凝膠化，但是由于比例過(guò)高，在攪拌 時(shí)已經(jīng)有膠原開(kāi)始析出，不易攪拌均勻，影響了整體凝膠化程度，也可以看出體 系中改性CMC的含量在動(dòng)力學(xué)上影響凝膠化反應(yīng)進(jìn)行的速率。實(shí)驗(yàn)也引入純膠原 做為對(duì)比樣，其在醋酸酸解下基本完全解離，可視為凝膠含量為零。

　　

　　3.3改性CMC/膠原冷凍凝膠的溶脹性圖3.5不同配比的改性CMC/膠原 冷凍凝膠的溶脹動(dòng)力學(xué)曲由圖3.5可知，在模擬體液的環(huán)境中，凝膠樣品溶脹十分迅速，1min內(nèi)溶脹 速率可以急速增大，溶脹度可以達(dá)到15左右；溶脹過(guò)程在30min后漸趨平緩，溶 脹速率降低，即不同比例的樣品的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線趨勢(shì)大致相同。

　　

　　圖3.6不同比例的改性CMC/膠原冷 凍凝膠的平衡溶脹度凝膠用作藥物傳遞系統(tǒng)時(shí)，平衡溶脹度是一個(gè)十分重要的參數(shù)，其大小直接 影響藥物釋放程度[4]。從圖32.6中可以得到，在各種樣品膠原質(zhì)量相同的情況下， 成膠率高的水凝膠平衡溶脹度較高。具體原因大概是成膠率高的水凝膠在冷凍干 燥過(guò)程中，其結(jié)構(gòu)比較均勻，分子間的空間大小合適，適宜溶劑滲透和擴(kuò)散，最 終體現(xiàn)在平衡溶脹度的提高。

　　

　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程，由于擦拭凝膠表面水分這一操作很難量化和標(biāo)準(zhǔn)化，不同比例樣 品間溶脹度的差異很可能由于操作帶來(lái)的誤差而難以分辨。而通過(guò)對(duì)不同比例水 凝膠的平衡溶脹度進(jìn)行對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)四組之間差距其實(shí)很小，即使是比例改變 較大的兩組之間差距依然很小。原因可能是改性CMC/膠原的配比相差比較懸殊， 膠原占了主導(dǎo)地位且膠原質(zhì)量相當(dāng)，故總體溶脹差別較小。

　　

　　3.4改性CMC/膠原冷凍凝膠的抗酶降解能力CMC/膠原冷凍凝膠的抗膜酶降解性冷凍凝膠和純膠原的溶血性所謂生物降解，是指材料在體內(nèi)或模擬體液環(huán)境中的降解。除化學(xué)降解外， 酶降解是生物體內(nèi)的特征降解反應(yīng)[5]。

　　

　　從圖3.8中可以看出，共混凝膠的對(duì)酶解耐受性能力與其成膠率有一定關(guān)系， 即成膠率越高的比例樣品，其抗酶降解能力越強(qiáng)。同時(shí)對(duì)比純膠原抗酶降解能力 (純膠原的酶解后的殘重比不到20%)，發(fā)現(xiàn)共混凝膠的對(duì)酶降解的耐受性得到很 大提高?？姑附到饽芰Φ奶岣咧饕Q于改性CMC與膠原纖維生成了共價(jià)鍵，具 有很高鍵能，遠(yuǎn)高于純膠原纖維之間以氫鍵為主的物理交聯(lián)作用，不容易被破壞； 并且藉由交聯(lián)作用將線型分布的水解膠原纖維轉(zhuǎn)變成具有三維空間延展性的凝膠 結(jié)構(gòu)，增加了樣品的聚集程度和堆積密度，使酶分子吸附、滲入、瓦解凝膠的阻 力增大，延長(zhǎng)了降解作用的時(shí)間。因此，隨著成膠率的上升，共混凝膠內(nèi)部的高 能共價(jià)鍵也增加，相應(yīng)就提高了對(duì)酶降解的耐受性?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)改性CMC的含 量來(lái)制備具有特征降解速率的共混凝膠。

　　

　　3.5改性CMC/膠原冷凍凝膠的溶血性溶血性是血液相容性的重要組成部分，也是檢測(cè)材料是否具有血液毒性的重 要手段，因此它是評(píng)價(jià)材料生物相容性的重要指標(biāo)。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)采用的游離血紅 蛋白直接測(cè)定法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，兔和人的紅細(xì)胞有相同的溶血性能，規(guī)定也可以 用兔的稀釋血代替人血。

　　

　　由圖3.8可知，純膠原的溶血率為6.0%，隨著體系中改性CMC含量的增加， 改性CMC/膠原冷凍凝膠的溶血率會(huì)逐漸降低至0.5%。我認(rèn)為原因是因?yàn)槟z原分 子上原有的溶血性基團(tuán)因改性CMC的交聯(lián)作用形成高分子長(zhǎng)鏈而鈍化，使溶血率 降低。由于改性CMC含量很少，基本沒(méi)有游離的醛基，所以不能看出改性CMC 是否能直接影響溶血性。按照溶血性測(cè)試的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)制備的凝膠材料在溶血性 方面適合應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，當(dāng)對(duì)材料的溶血性的要求較嚴(yán)格時(shí)，可以選擇改 性CMC含量較大的配比。

　　

　　4.結(jié)論(1) 實(shí)驗(yàn)制備的改性CMC/膠原冷凍凝膠中改性CMC起交聯(lián)劑的作用。在一定 范圍內(nèi)，凝膠含量（交聯(lián)度）與冷凍時(shí)間和改性CMC含量呈正相關(guān)，凝膠生成速 率隨改性CMC含量增加而提升。

　　

　　(2)從FT-IR圖譜中看出，改性CMC的游離醛基基本完全被反應(yīng)，且不同比例 的冷凍凝膠圖譜十分相似，即說(shuō)明它們的結(jié)構(gòu)都很相似，只是成膠率不同而已， 且沒(méi)有改變膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)。

　　

　　(3)各種配比的改性CMC/膠原冷凍凝膠在PBS中的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線相似，且最 終平衡溶脹度較高，可以考慮應(yīng)用于藥物緩釋控釋中。平衡溶脹度跟成膠率有一 定正相關(guān)，但是并不明顯。

　　

　　(4)改性CMC/膠原冷凍凝膠屬于生物可降解材料。調(diào)節(jié)改性CMC含量可以有 效改善對(duì)酶降解的耐受能力，得到具有特征降解程度和速率的凝膠材料。

　　

　　(5)溶血性能檢測(cè)表明本實(shí)驗(yàn)制備的改性CMC/膠原冷凍凝膠為非溶血性材料。